摘要
為了減輕化療藥物對(duì)健康組織的不良影響，一種有前景的新方法是將聲動(dòng)力療法與局部化療相結(jié)合，以提高抗癌藥物的治療效果。在本研究中，引入了一種多功能原位殼聚糖水凝膠（CS），其中包含負(fù)載阿霉素的絲素蛋白納米顆粒（DOXSFNPs）和 CuO/TiO?納米顆粒（CTNPs）用于聯(lián)合治療。所制備的 DOXSFNPs 粒徑為257±6nm，zeta 電位為-14.3±1.8mV，載藥率高達(dá)12.38±1.73%。觀察到 DOX 從 DOXSF2/CS2 中的 pH 依賴性控釋比從 DOX/CS2 中更為顯著。MTT 結(jié)果表明，CT/CS2 在超聲輻射（US）下的毒性呈劑量依賴性。研究結(jié)果顯示，治療后活性氧（ROS）產(chǎn)量增加了 1.83 倍，CT3-DOXSF2/CS2-US 的 IC50 相比 CT3/DOXSF2/CS2 降低了58%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和組織病理學(xué)染色表明，CT3/DOXSF2/CS2-US 治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率最高，達(dá)到約83.65%。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了該方法在最小化化療不良影響的同時(shí)最大化治療效果的潛力，為癌癥治療領(lǐng)域做出了有價(jià)值的貢獻(xiàn)。
研究?jī)?nèi)容
該研究旨在開發(fā)一種基于多糖的具有適當(dāng)物理和化學(xué)性質(zhì)的生物活性水凝膠，用于在乳腺癌治療中結(jié)合化療和 SDT。特別研究了負(fù)載 DOX 的 SF - NPs（DOXSF/CS）的 CS 水凝膠對(duì)化療藥物的控釋潛力。因此，該研究首先將 DOX 負(fù)載到 SFNPs 中，然后將 DOX - SFNPs 和 CuO - TiO?納米顆粒（CTNPs）分散在 CS 水凝膠基質(zhì)（CT - DOXSF/CS）中，以制備具有合適生物學(xué)和機(jī)械性能的所需水凝膠。對(duì)制備的水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶脹率、降解率、機(jī)械和流變學(xué)性能以及細(xì)胞相容性進(jìn)行了全面研究。該研究在體外和體內(nèi)評(píng)估了這些水凝膠的抗癌效果。（Scheme 1）
Scheme1 CT-DOXSF/CS水凝膠作用機(jī)制及其在4T1腫瘤模型小鼠中化療-SDT聯(lián)合治療示意圖
絲素蛋白納米顆粒（SFNPs）不僅穩(wěn)定性高、無毒，還能實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放。阿霉素 “搭乘” SFNPs 這趟 “列車”，被精準(zhǔn)輸送到腫瘤組織。經(jīng)檢測(cè)，制備的 DOXSFNPs 粒徑為257±6nm，zeta電位為 -14.3±1.8mV，載藥率高達(dá) 12.38±1.73%。此外，TNPs和CTNPs的EDAX結(jié)果表明，在二氧化鈦結(jié)構(gòu)中加入氧化銅后，Cu重量百分比增加到1.62 %，表明CT納米顆粒的合成成功。XRD 表明合成的TiO?以銳鈦礦相為主并含少量金紅石相，CTNPs 出現(xiàn)與CuO衍射峰 ；FTIR 分析了其化學(xué)組成但CuO在特定區(qū)域特征峰不明顯；用 DCFH - DA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) CTNPs 產(chǎn)生的 ROS 顯著多于 TNPs，因其能增強(qiáng)電子 - 空穴對(duì)分離等提升 ROS 產(chǎn)量，后續(xù)將基于 CTNPs 研究聲動(dòng)力療法對(duì)水凝膠抗腫瘤特性的影響。（圖1）
圖1 TNPs和CTNPs的的表征
為探究 TNPs 和 CTNPs 產(chǎn)生 ROS 的水平差異及其在癌癥治療中的應(yīng)用，利用 DCFH-DA 作為探針檢測(cè) MCF-7 細(xì)胞系中的 ROS 水平，通過 CLSM 和 ELISA 對(duì)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示 CTNPs 產(chǎn)生的 ROS 顯著多于 TNPs。這是因?yàn)樵赥iO2中引入 CuO 后能產(chǎn)生新電子態(tài)，增強(qiáng)電子-空穴對(duì)分離，同時(shí) CuO 作為助催化劑可促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移、防止復(fù)合，其催化特性還能加強(qiáng)與氧和水分子的作用，并且銅參與的類芬頓反應(yīng)也有助于產(chǎn)生更多 ROS。基于此，后續(xù)將利用 CTNPs 深入研究聲動(dòng)力療法對(duì)水凝膠抗腫瘤特性的影響。（圖2）
圖2 細(xì)胞內(nèi)ROS評(píng)估
FE-SEM 圖像和 DLS 數(shù)據(jù)均顯示 SFNPs 呈球形且尺寸分布均勻，其初始粒徑為257±3nm，ζ 電位為- 20.6±2.8mV，PDI 為 0.091。負(fù)載 DOX 后，SFNPs 粒徑增大至約 288±7.6nm，PDI 變?yōu)?0.130，ζ 電位轉(zhuǎn)變?yōu)?14.3±1mV ，說明負(fù)載 DOX 主要影響了 SFNPs 的粒徑，對(duì) ζ 電位影響較小。（圖3）
圖3 SFNPs和DOXSFNPs的掃描電鏡圖像
接著，本研究指出 CS 的流變學(xué)特性與凝膠化溫度受濃度、pH 及添加劑等因素影響，DOXSFNPs 和Cu - TiO?納米顆粒分別通過靜電、氫鍵、配位及范德華力等與 CS 相互作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1%（w/w）的 SFNPs 濃度對(duì)凝膠化時(shí)間最佳，增加 CT 含量會(huì)降低凝膠化溫度、提升模量與交聯(lián)密度，且 CT3 - SF2/CS2 樣品粘彈性增強(qiáng)，其G'/G''比值增大，材料行為趨近彈性，CT 還可能影響復(fù)合材料拉伸強(qiáng)度與模量。在溶脹率方面，37°C 的 PBS 中，CS2 和 CT3 - SF2/CS2 水凝膠 24 小時(shí)內(nèi)達(dá)最大溶脹，添加 SFNPs 和 CT 降低了溶脹百分比，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。降解率監(jiān)測(cè)顯示，從第 10 天起，CT3 - SF2/CS2 樣品降解速率低于 CS，這是因?yàn)?SFNPs 和 CTNPs 與 CS 的分子作用改變了水凝膠交聯(lián)密度和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響降解行為。（圖4）
圖4 水凝膠的模量、溶脹及降解
通過在 CS 中摻入 GP 得到溫度敏感型水凝膠 CT3 - SF2/CS2。這種水凝膠在 25°C 時(shí)能以溶液狀態(tài)用注射器注射，37°C 時(shí)發(fā)生凝膠化。FE - SEM 顯示 CS2 水凝膠具連通多孔微觀結(jié)構(gòu)，利于水和藥物或細(xì)胞滲透負(fù)載，是藥物遞送和組織工程的潛在材料。理想抗腫瘤水凝膠需特定孔徑和孔隙率范圍，實(shí)驗(yàn)測(cè)得 CS2 和 CT3 - SF2/CS2 凍干水凝膠平均孔徑分別為 85.39±12.41μm 和 61.04±21.85μm，添加 SFNPs/CT 使孔徑減?。≒ = 0.0038）；二者平均孔隙率分別約 79.25% 和 63.42%，CT3 - SF2/CS2 孔隙率降低是因 SF 與 CS 間形成氫鍵致結(jié)構(gòu)致密，因其孔隙率在可接受范圍，故適用于局部抗腫瘤應(yīng)用。（圖5）
圖5 水凝膠的表征
通過溶血測(cè)試評(píng)估兩者的相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng) SF2/CS3、CT3/CS2 和 CT3 - SF2/CS2 水凝膠提取物處理的紅細(xì)胞溶血活性與陰性對(duì)照相當(dāng)，孵育 2 小時(shí)后，SF2/CS2 致紅細(xì)胞溶血率僅 1.25±0.271%，所有水凝膠溶血率均低于 5%，符合標(biāo)準(zhǔn)。綜上，所研究水凝膠與紅細(xì)胞相容性佳，為其用于抗癌應(yīng)用提供了有力支持。（圖6）
圖6 水凝膠溶血實(shí)驗(yàn)及TGA分析
在負(fù)載方面，SFNPs 表面與疏水性氨基酸殘基的相互作用及靜電引力促使 DOX 負(fù)載，且其載藥量高（15% w/w 時(shí)，DL 達(dá) 12.38±1.73% ，EE 達(dá) 95.3±2.01%）。釋放研究中，模擬癌細(xì)胞環(huán)境，監(jiān)測(cè) 21 天發(fā)現(xiàn) DOX 在 pH 7.4 時(shí)緩慢釋放，pH 5.5 時(shí)大量釋放，如 DOX/CS2 在 pH 5.5 釋放最快，這是因?yàn)榈?pH 下 CS 中氨基質(zhì)子化致溶脹、DOX 離子化增強(qiáng)。而 pH 5.5 時(shí) DOX 從 SFNPs 釋放增加，或因酸性環(huán)境影響 SFNPs 穩(wěn)定性及與 DOX 的相互作用。DOXSF2/CS2 釋放速率比 DOX/CS2 慢，精準(zhǔn)控制釋放速率可減少對(duì)健康組織影響，保證癌細(xì)胞對(duì)治療藥物的持續(xù)接觸 。（圖7）
圖7 體外DOX釋放譜
接著，通過多種實(shí)驗(yàn)研究了含 CT 和 DOX 的水凝膠對(duì) MCF - 7 細(xì)胞的作用及機(jī)制。MTT 實(shí)驗(yàn)表明，DOXSF2/CS2 的細(xì)胞毒性低于游離 DOX，體現(xiàn)了其對(duì) DOX 的控釋作用；CTx/CS2 對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，CT4/CS2 - US 因超聲下 CT 產(chǎn)生 ROS 而表現(xiàn)出顯著毒性，CTx - DOXSF2/CS2 - US 的抗癌效果比 CTx - DOXSF2/CS2 更顯著，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 的 IC50 更低，且 CT 濃度增加會(huì)加大照射與未照射配方的差異。Annexin V/PI 雙染法驗(yàn)證 MTT 結(jié)果，發(fā)現(xiàn) CT3 - DOXSF2/CS2 - US 處理的細(xì)胞凋亡率更高，CT 通過產(chǎn)生 ROS、損傷 DNA 等誘導(dǎo)凋亡，DOX/CS2 比 CT3 - DOXSF2/CS2 引發(fā)的凋亡更顯著，因?yàn)槠?DOX 釋放更快。CLSM 圖像顯示 CT3 - DOXSF2/CS2 中的 DOX 呈控釋狀態(tài)。（圖8）
圖8 含 CT 和 DOX 的水凝膠對(duì) MCF - 7 細(xì)胞的作用及機(jī)制
研究人員將水凝膠皮下注射到小鼠背部，用卡尺測(cè)量體積并通過手術(shù)直接觀察其在1 - 21天內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)水凝膠呈透明狀且隨時(shí)間逐漸變小，這是由于 CS 聚合物釋放導(dǎo)致降解。測(cè)量水凝膠重量發(fā)現(xiàn)，注射 12、15、21 天后，其重量損失分別約為 43.51%、56.76%、75.94% 。對(duì)水凝膠周圍組織進(jìn)行組織學(xué)分析，雖在注射后第 6 天出現(xiàn)急性炎癥，但從第 9 天開始炎癥明顯減輕，到第 21 天基本消失，證明該水凝膠生物相容性良好。
圖9 含體外生物降解分析
通過對(duì)患有 4T1 腫瘤的雌性 BALB/c 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了 DOX/CS2 和 CT3 - DOXSF2/CS2 的抗腫瘤效果、全身毒性及生存率情況。在抗腫瘤效果方面，對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)迅速，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 組腫瘤體積減小最明顯，超聲激活 CT 納米顆粒產(chǎn)生的 ROS 與腫瘤體積減小有關(guān)，第 3 天起不同治療組間陸續(xù)出現(xiàn)顯著差異，DOX 從 DOXSFNPs 的控釋提高了療效，體現(xiàn)出局部遞送 DOX 的優(yōu)勢(shì)。全身毒性實(shí)驗(yàn)中，靜脈注射 DOX 使小鼠體重下降，而 CT3 - DOXSF2/CS2 - US 和 CT3 - DOXSF2/CS2 組體重穩(wěn)定，顯示出較低毒性。生存率上，CT3 - DOXSF2/CS2 組在 21 天內(nèi)無死亡，CT3 - DOXSF2/CS2 - US 組第 6 天出現(xiàn) 1 例死亡，靜脈注射 DOX 組平均生存率為 18 天 。
圖10 水凝膠在腫瘤小鼠中的體內(nèi)性能
通過染色觀察腫瘤的有絲分裂指數(shù)、核多形性和細(xì)胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的 MI 和 NP 值最高，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂活躍。DOX/CS2 組凋亡面積小于其他組，但相比對(duì)照組仍有顯著差異且 MI 較低。CT3 - DOXSF2/CS2 組因 SF 持續(xù)釋藥，在注射部位周邊腫瘤區(qū)域誘導(dǎo)出更多凋亡；DOX/CS2 組因藥物被鄰近組織快速吸收，局部療效受限，凋亡面積小。CT3 - DOXSF2/CS2 - US 組凋亡水平更高，體現(xiàn)了 CT 聲動(dòng)力療法與 DOX 控釋的協(xié)同促凋亡作用。經(jīng) SDT 后，CT 納米顆粒產(chǎn)生的 ROS 會(huì)損傷細(xì)胞成分、激活信號(hào)通路，促使細(xì)胞凋亡并增加對(duì) DOX 的敏感性?？傮w上，CT3-DOXSF2/CS2 和CT3-DOXSF2/CS2 - US 組在高凋亡水平下，MI 和 NP 值低于 IVDOX 組 。
圖11 不同治療組乳腺腫瘤21天后的組織切片分析
結(jié)論
本研究旨在設(shè)計(jì)一種針對(duì)乳腺癌的局部聯(lián)合療法，以優(yōu)化治療效果，并最大限度減少對(duì)其他組織的潛在副作用。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，我們使用了一種可注射的殼聚糖（CS）水凝膠，將氧化銅-二氧化鈦納米顆粒（CT）和負(fù)載阿霉素的絲素蛋白納米顆粒（DOXSFNPs）局部遞送至腫瘤部位，用于聯(lián)合化療和聲動(dòng)力療法（SDT）。絲素蛋白納米顆粒（SFNPs）的粒徑為276納米，對(duì)阿霉素（DOX）的負(fù)載效率高達(dá)95.4%。對(duì)水凝膠的物理化學(xué)評(píng)估表明，添加絲素蛋白納米顆粒改善了其機(jī)械性能和粘彈性，且未對(duì)其溶脹或降解產(chǎn)生顯著影響。該水凝膠在21天后在體內(nèi)的降解率為75.87%。體外釋放研究顯示，在21天內(nèi)，水凝膠中DOX的累積釋放率為78%，這表明該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)順序控釋。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在聲動(dòng)力療法下，CT納米顆粒在MCF-7細(xì)胞中比二氧化鈦納米顆粒（TNPs）產(chǎn)生更多的活性氧（ROS），這體現(xiàn)了銅的催化特性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與施加超聲時(shí)相比，負(fù)載納米顆粒的水凝膠的半數(shù)抑制濃度（IC50）值更高。另外，與水凝膠組相比，接受超聲處理的細(xì)胞存活率顯著降低（約降低兩倍）。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，負(fù)載DOX的納米顆粒與聲動(dòng)力療法的聯(lián)合治療對(duì)減小腫瘤體積的效果更顯著，組織病理學(xué)分析也顯示其有更低的有絲分裂指數(shù)?？傊覀儗T納米顆粒作為聲動(dòng)力治療劑與DOXSFNPs相結(jié)合的聯(lián)合療法，為更好地治療癌癥提供了一種有前景的方法。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.138910
論文信息
Gao Y, Dai C, Zhang M, et al. Biomimetic Silk Fibroin Hydrogel for Enhanced Peripheral Nerve Regeneration: Synergistic Effects of Graphene Oxide and Fibroblast Exosome.
Maghsoudian, S., Yektakasmaei, M. P., Shaabani, A., et al. Synergistic effects of doxorubicin loaded silk fibroin nanoparticles and Cu-TiO2 nanoparticles for local chemo-sonodynamic therapy against breast cancer. International journal of biological macromolecules, 289, 138910.
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