摘要
家蠶的絲腺能夠合成大量高分子量的絲素蛋白，形成絲素纖維，被認(rèn)為是一種生物反應(yīng)器，可將外源蛋白整合進(jìn)絲素纖維，制備功能性蠶絲生物材料。最近，受益于基因技術(shù)的應(yīng)用，絲腺有望成為大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白的生物反應(yīng)器。Fib-H基因表達(dá)系統(tǒng)能夠超高效合成絲纖維蛋白，是最有前途的合成外源性蛋白的系統(tǒng)。然而大多數(shù)用Fib-H系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白水平較低（僅占繭質(zhì)量的0.95%~6.0%），因此大規(guī)模生產(chǎn)仍是挑戰(zhàn)。本研究建立了一個高效的Fib-HEXP生物合成體系，利用轉(zhuǎn)基因蠶在絲纖維中合成大量重組RFP，占絲質(zhì)量的7.86%，實現(xiàn)了熒光絲蛋白（SF）生物材料的制備。通過基因工程葡萄糖氧化酶（GOx）功能化絲纖維驗證了Fib-HEXP系統(tǒng)的普適性。制備了葡萄糖/葡萄糖酸/過氧化氫水凝膠，通過葡萄糖酸和過氧化氫的酶催化反應(yīng)，促進(jìn)小鼠感染糖尿病創(chuàng)面的愈合。
圖1 絲腺生物合成系統(tǒng)實現(xiàn)絲纖維中外源蛋白高效表達(dá)和絲纖維基生物材料功能化示意圖
研究內(nèi)容
如圖2a所示，為了實現(xiàn)外源基因在家蠶后部絲腺（PSG）中的時空特異性和高效表達(dá)，研究者從家蠶基因組中擴(kuò)增出了一個1967 bp長度的基礎(chǔ)Fib-H啟動子，將紅色熒光蛋白（RFP）的編碼序列（CDS）和Fib-H轉(zhuǎn)錄終止子（FibHPA）依次連接到基礎(chǔ)Fib-H啟動子下游，插入pBac轉(zhuǎn)基因載體，形成基本的Fib-HEXP系統(tǒng)（FRFEXP）。為提高FRF的轉(zhuǎn)錄效率，研究者在基礎(chǔ)Fib-H啟動子上游添加一個hr3CQ增強(qiáng)子，形成HFRFEXP系統(tǒng)；為進(jìn)一步提高外源基因的mRNA穩(wěn)定性，研究者將FibHPA替換為Ser1PA轉(zhuǎn)錄終止子，形成最終的HFRSEXP系統(tǒng)。隨后，將以上三個系統(tǒng)微注射到家蠶胚胎中，生成可持續(xù)表達(dá)RFP的可遺傳轉(zhuǎn)基因家蠶。與FRF系統(tǒng)相比，HFRS和HFRF系統(tǒng)表達(dá)的RFP分別增加了7.2倍和4.1倍，表明優(yōu)化后的HFRSEXP實現(xiàn)了天然分子量的重組蛋白在PSG中的高效表達(dá)并分泌到絲纖維中（圖2c-g）。
圖2 Fib-HEXP系統(tǒng)的構(gòu)建
為提高HFRS系統(tǒng)的繭產(chǎn)量，研究者將其與富含絲膠的棉繭家蠶品系雜交至少5代，以繭大小、顏色、繭殼重量篩選為穩(wěn)定的生產(chǎn)線，生產(chǎn)大量粉紅色蠶絲（圖3a-f）。將粉紅色蠶絲酶解、層析，可獲得純化純度超過98%的RFP，剩余的絲纖維可制備再生絲素溶液（圖3g-h）。將純化RFP與再生絲素溶液按所需比例混合可獲得RFP-絲纖維溶液，可用于制備RFP熒光纖維薄膜、注射水凝膠、多孔海綿等各種材料（圖3i-l）。
圖3 利用Fib-HEXP系統(tǒng)合成重組RFP，制備熒光絲生物材料
葡萄糖氧化酶（GOx）是一種結(jié)合葡萄糖并催化其轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氫（H2O2）的天然酶，被認(rèn)為是糖尿病創(chuàng)面中抗菌和調(diào)節(jié)高糖微環(huán)境的候選酶。因此對于開發(fā)一種能夠合成GOx、固定GOx、保持GOx活性，實現(xiàn)可控GOx釋放的載體需求很高。為實現(xiàn)GOx在家蠶絲中的高效表達(dá)，研究者將黑曲霉GOx成熟肽編碼序列根據(jù)家蠶的密碼子使用偏好進(jìn)行優(yōu)化，并插入到HFRSEXP中形成轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac-HFGOxS（圖4a）。隨后，將pBac-HFGOxS微注射到家蠶胚胎中，生成可持續(xù)表達(dá)GOx的可遺傳轉(zhuǎn)基因家蠶。獲得的蠶絲中GOx含量可達(dá)80g/kg，活性達(dá)32000U/g蠶絲，GOx穩(wěn)定性大幅提高（圖4c-e）。如圖4f-i，研究者將上述轉(zhuǎn)基因蠶與富絲和棉繭蠶品系多次雜交，實現(xiàn)含GOx蠶絲的大量生產(chǎn)（含1.38g GOx/1kg蠶絲，純度超95%，活性達(dá)425U/mg）。
圖4 利用Fib-HEXP系統(tǒng)大量合成重組GOx
在葡萄糖存在下，研究者將GOx-silk與細(xì)菌共培養(yǎng)，證明GOx-silk能抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌附著生長，甚至強(qiáng)于3% H2O2，表明GOx-silk不斷催化葡萄糖生成H2O2，形成持續(xù)的抗菌效果（圖4j-k，圖5a-f）。另外，可將GOx從蠶絲中提取出來，不破壞其結(jié)構(gòu)和抑菌作用（圖5g-j）。
圖5 葡萄糖存在下，GOx-silk的抗菌性能評價
四氧化三鐵納米顆粒能夠進(jìn)一步催化H2O2生成抗菌活性羥基，將其與GOx-silk結(jié)合能進(jìn)一步提高抗菌性。研究者制備了GOx/Fe3O4-SFH水凝膠，光學(xué)透明，形態(tài)均勻，凍干后具有結(jié)構(gòu)完整，具有3D互通多孔結(jié)構(gòu)，孔徑30-90μm，孔隙率超55%（圖6a-e）。GOx/Fe3O4-SFH水凝膠吸水能力強(qiáng)，能夠快速溶脹，24h溶脹率可達(dá)2000%，體外能夠快速降解，PBS中8天降解25%（圖6f-i）。以上表明該水凝膠適合作為軟組織工程的三維基質(zhì)。水凝膠中引入Fe3O4后，級聯(lián)催化反應(yīng)表明GOx能夠有效催化葡萄糖生成H2O2，并通過Fe3O4進(jìn)一步催化H2O2為·OH（圖6q）。
圖6 抗菌絲素水凝膠的制備
將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)液與GOx/Fe3O4-SFH水凝膠共培養(yǎng)10h，結(jié)果表明GOx/Fe3O4-SFH水凝膠能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長，掃描電鏡顯示菌體表面不規(guī)則、萎縮，表明細(xì)菌死亡（圖7a-i）。GOx/Fe3O4-SFH水凝膠以100μg/mL劑量處理NIH-3T3細(xì)胞，沒有明顯的細(xì)胞死亡，CCK8實驗進(jìn)一步表明GOx/Fe3O4-SFH水凝膠與NIH-3T3細(xì)胞具有良好的相容性（圖7j-k）。GOx/Fe3O4-SFH水凝膠與紅細(xì)胞接觸后未觀察到溶血現(xiàn)象，說明水凝膠具有良好的血液相容性（圖7l-m）。
圖7 抗菌絲素水凝膠的細(xì)菌耐藥性、抑菌性和生物相容性
研究者采用糖尿病小鼠模型，如圖8a所示，在小鼠背部切除皮膚形成直徑8mm的全厚度傷口，金黃色葡萄球菌感染30min后，將GOx/Fe3O4-SFH水凝膠覆蓋在傷口上。12天后，GOx/Fe3O4-SFH水凝膠傷口僅剩余11.14%沒有愈合，未愈合傷口處幾乎檢測不到金黃色葡萄球菌（圖8b-e）。H&E結(jié)果顯示傷口處出現(xiàn)相對連續(xù)和扁平的上皮細(xì)胞，真皮層發(fā)育良好，并存在毛囊和皮脂腺（圖8f），Masson結(jié)果顯示膠原纖維交織排列（圖8g），免疫熒光結(jié)果顯示組織中CD31（血管生成標(biāo)記物）和CD206（M2標(biāo)記物）顯著增強(qiáng)，表明血管生成加速，巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化（圖9）。綜上，GOx/Fe3O4-SFH水凝膠能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，從而顯著促進(jìn)慢性傷口愈合。
圖8 抗菌絲素水凝膠的體內(nèi)評價
圖9 抗菌絲素水凝膠的免疫熒光分析
結(jié)論
本研究成功構(gòu)建了Fib-HEXP系統(tǒng)，實現(xiàn)了具有生物活性外源蛋白的高效表達(dá)。利用此系統(tǒng)將PSG和GOx外源蛋白整合到到蠶絲纖維中，RFP功能化絲纖維材料能夠證明外源蛋白的生物活性維持，GOx功能化絲纖維能夠促進(jìn)感染慢性傷口的愈合。綜上所述，F(xiàn)ib-HEXP系統(tǒng)在遺傳學(xué)方面為絲纖維生物材料的功能化提供了途徑，從而拓寬了絲纖維生物材料的應(yīng)用。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1002/adma.202414878
通訊作者簡介
夏慶友，西南大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，西南大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院生物學(xué)研究中心 主任，蠶桑重慶市重點實驗室 主任，重慶市蠶絲纖維新材料工程技術(shù)研究中心 主任，國家重要人才獎勵計劃特聘教授，國家級人才計劃首批百千萬工程領(lǐng)軍人才，國家自然科學(xué)二等獎獲得者（第一貢獻(xiàn)人），愛思唯爾2019/2020/2021/2022/2023“中國高被引學(xué)者”。主要從事家蠶基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、基因組編輯與轉(zhuǎn)基因抗病育種、絲蛋白性能改造、家蠶規(guī)?；N質(zhì)創(chuàng)制、蠶?，F(xiàn)代技術(shù)革新等方面的研究。先后主持了“973”、“863”、國家科技攻關(guān)、國家自然科學(xué)基金重點、國際合作項目等重大研究項目；主持完成家蠶基因組計劃、家蠶基因芯片研發(fā)、家蠶基因組數(shù)據(jù)庫、家蠶轉(zhuǎn)基因與基因組編輯平臺構(gòu)建等研究，建立人工飼料規(guī)模化和工廠化養(yǎng)蠶技術(shù)體系。在Science、Nat Biotechnol、PNAS、Genome Biology、JBC等國際著名雜志發(fā)表論文500余篇。
文章信息
An Efficient Biosynthetic System for Developing Functional Silk Fibroin-Based Biomaterials[J], Advanced Materials, 2024, 2414878.
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