摘要
絲素蛋白作為支架材料廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)，然而，其復(fù)雜的制造工藝限制了其更廣泛的臨床應(yīng)用。資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)桑蠶紡織和生物質(zhì)學(xué)院代方銀教授團(tuán)隊(duì)首次利用具有連續(xù)絲纖維、多孔層次結(jié)構(gòu)和優(yōu)越力學(xué)性能特征的平板絲（FSC）制備生物支架。通過聚多巴胺（PDA）的粘附作用介導(dǎo)鎂離子（Mg2+）組裝到FSC支架上，得到的TH-PDA@Mg支架顯示出特殊的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)越的表面特性和優(yōu)良的生物相容性，同時(shí)還展現(xiàn)出顯著的免疫調(diào)節(jié)和成骨再生能力，在臨床治療骨缺損中具有廣闊前景。
一、支架的制備及相關(guān)理化性能
使用三元溶液處理熱壓過的平板絲（FSC）表面，得到THFSC，再室溫浸泡于含不同濃度硫酸鎂的多巴胺溶液中24h，得到各組含鎂樣品，改性后的支架由白色變?yōu)樯钭厣▓Da）。從應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖d）可以看出，Mg2+加載后，支架力學(xué)性能得到提升。同時(shí)，支架的降解速率得到減緩，溶脹率提高，表明PDA的存在增強(qiáng)了支架的親水性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖e、圖f、圖h）。模擬體液SBF的生物礦化實(shí)驗(yàn)（圖k）中，在TH-PDA和TH-PDA@Mg1組別的表面上觀察到明顯的磷灰石形成，表面修飾后促進(jìn)羥基磷灰石（HA）形成的能力增強(qiáng)。這種HA層的有效形成可能基于SBF中離子和PDA中的兒茶酚胺基團(tuán)之間存在強(qiáng)大的相互作用。
圖1 支架的制備及相關(guān)理化性能
二、支架的細(xì)胞附著與毒性
細(xì)胞毒性試驗(yàn)（圖a）表明，引入PDA后具有提升的細(xì)胞活力，適量加入Mg2+對于細(xì)胞活性也有提升。使用TH-PDA@Mg1作為支架組別，該組別活死染色（圖b-f）展現(xiàn)出良好的生物相容性和最小的細(xì)胞毒性。從細(xì)胞在支架上的粘附情況（圖g）可以看出，TH-PDA和TH-PDA@Mg1支架明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附，表面細(xì)胞呈拉長和分散的狀態(tài)，具有絲狀偽足和片狀偽足的延伸。這可能與支架表面結(jié)構(gòu)變化及增強(qiáng)的細(xì)胞-物質(zhì)相互作用有關(guān)。
圖2 支架的細(xì)胞毒性與粘附
三、支架的體外成骨分化
TH-PDA@Mg1可顯著促進(jìn)體外成骨相關(guān)基因和骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。ALP活性檢測中只有TH-PDA@Mg1支架表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的藍(lán)色染色（圖a），ALP定量結(jié)果（圖b）同時(shí)反映了MC3T3- E1細(xì)胞中成骨細(xì)胞代謝活性的增強(qiáng)。ARS染色中（圖c），TH-PDA@Mg1組表現(xiàn)出明顯的代表鈣質(zhì)ars復(fù)合物的亮紅色斑點(diǎn)，定量分析顯示TH-PDA@Mg1組礦化結(jié)節(jié)形成明顯增加（圖d）。qRT-PCR結(jié)果反映TH-PDA@Mg1組中分化細(xì)胞的OPN、Runx- 2、氰酸鹽和Col I的mRNA表達(dá)水平（圖e-h）顯著增加，這與鎂離子可以通過激活典型的Wnt信號通路等原因來促進(jìn)成骨分化有關(guān)。
圖3 支架的體外成骨分化
四、支架的巨噬細(xì)胞極化
促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1向M2表型極化，可能是促進(jìn)骨缺損區(qū)骨形成的關(guān)鍵。除促進(jìn)RAW246.7細(xì)胞增殖（圖a）外，TH-PDA@Mg1組與M2相關(guān)的MRC-1染色強(qiáng)度最為顯著，與M1相關(guān)的iNOS較弱，證實(shí)了TH-PDA@Mg1能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化。結(jié)合HFSC和THFSC組染色結(jié)果，表明SF、PDA 和鎂離子再加速巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮協(xié)同作用。
圖4 支架的巨噬細(xì)胞極化
五、支架的大鼠顱骨缺損體內(nèi)修復(fù)效果
對SD大鼠顱骨缺損用THPDA@Mg1復(fù)合多孔支架、THFSC支架填充，對6周和12周的顱骨進(jìn)行顯微ct和免疫組化分析。顯微ct圖像（圖b）顯示，在第12周時(shí)，TH-PDA@Mg1支架上新形成的骨組織分布較其他兩組更明顯，表現(xiàn)出更優(yōu)越的新骨形成和增強(qiáng)的成骨性能。圖c中通過HE和Masson染色確定新骨的形成來評估骨的成熟度，術(shù)后12周，纖維組織厚度較6周增加，TH-PDA@Mg1處理組的新骨形成明顯增加；同時(shí)，在HE染色的切片中未觀察到局部炎癥細(xì)胞，表明支架具有良好的組織相容性。
圖5 支架的大鼠顱骨缺損體內(nèi)修復(fù)效果
結(jié)論
該研究團(tuán)隊(duì)通過將FSC與PDA和Mg2+集成用于骨缺損修復(fù)，開發(fā)了一種具有良好生物相容性的多功能復(fù)合支架。該方案簡化了絲素蛋白材料制備流程并降低成本，PDA和Mg2+的摻入顯著增強(qiáng)了MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、遷移和成骨分化。TH-PDA@Mg1支架還促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從M1促炎表型向M2促重構(gòu)表型的轉(zhuǎn)化，在顱骨缺損模型中表現(xiàn)出優(yōu)越的骨修復(fù)效果。具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化、巨噬細(xì)胞極化和體內(nèi)血管化等優(yōu)點(diǎn)，表明材料在一系列的骨科應(yīng)用中具有巨大的潛力，除應(yīng)對不同大小的骨缺損以外，還可用于治療炎癥性骨病或促進(jìn)傷口愈合。未來將這種支架與藥物傳遞系統(tǒng)或生長因子結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)靶向治療，并進(jìn)一步提高其再生潛力。目前的研究證明了基于FSC的支架的成骨和免疫調(diào)節(jié)潛力，未來的工作應(yīng)集中于改進(jìn)FSC支架制造工藝，同時(shí)優(yōu)化其制備方法，闡明其作用機(jī)制，并探索高價(jià)值利用和大規(guī)模采用的多功能應(yīng)用。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1088/2752-5724/ad9e09
通訊作者簡介
代方銀，博士，二級教授，博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院院長，國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系首席科學(xué)家，長期從事家蠶遺傳資源庫構(gòu)建發(fā)展、遺傳學(xué)與育種技術(shù)、蠶絲高值化利用等研究。郵箱為fydai@swu.edu.cn。
程嵐，博士，西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樘厥饫O絲種質(zhì)資源的挖掘與評價(jià)、蠶絲生物醫(yī)用材料的開發(fā)與應(yīng)用研究。郵箱為lancheng@swu.edu.cn。
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